30 минут митоза
С помощью лазерного пинцета русские научные работники отворили детали одного из самых загадочных процессов бытия - деления клетки
На экране является нечто, похожее на большое блюдце с шевелящимися червячками. Какое-то время они беспорядочно толкутся, но неожиданно как по команде начинают выстраиваться гладко посредине "блюдца". Несколько мгновений сей активный диаметр подрагивает, как как гром среди ясного неба невидимые ножницы разрезают его вдоль, и "червячки" синхронно разбегаются к двум "полюсам" по краям "блюдца". Примерно такую же картинку, вероятно менее четкую, держал под наблюдением больше трехсот годков вспять голландский галантерейщик, а по совместительству - страстный охотник до шлифовки линз и основоположник микроскопии Антони ван Левенгук. Сейчас же ее показывает в компьютере профессор кафедры биофизики физфака МГУ, шеф центра теоретических задач фармакологии РАН и завлаб Гематологического научного центра РАМН Фазли Атауллаханов. Это кадры из небольшого фильма о митозе - делении клетки, - снятого с помощью светового микроскопа американскими учеными. Блюдце - клетка, а червячки - хромосомы. И данная завораживающая картина до сих пор является для научных работников загадкой, несмотря на то что митоз изучают шибко давно.
Современная биология многое ведает о клетке, научным специалистам известны на практике все ее составляющие. Движение вглубь клетки оказывалось возможным благодаря постоянному совершенствованию техники: светового микроскопа, рентгеноструктурного анализа, электронного, а опосля и атомно-силового микроскопа. Изучение клетки необходимо и для розыске наиболее эффективных путей вмешательства в клеточные процессы. Ведь любая немочь - сиё сбой в службе клеток. Но полученные раньше знания не давали полного представления о механизмах процессов, происходящих в клетке. Совершенно свежие возможности у исследователей предстали только несколько лет назад, когда был создан инструмент, - тот, что называют лазерной ловушкой или лазерным пинцетом. Сейчас в мире несколько десятков научных групп с помощью этого инструмента проводят опыты по реконструкции внутриклеточных процессов. Одна из таких групп - под руководством Фазли Атауллаханова - первой выявила некие важнейшие детали "агрегата" деления клетки.
Фокус с ножницами
Первым, как фиксируют историки, клетку увидел Роберт Гук в 1663 году. Но его приспособление из пары линз давало 30−кратное увеличение, потому он мог видать в изучаемых срезах пробки лишь нечто похожее на соты, - те, что он назвал клетками. Прибор Левенгука увеличивал уже в 300 раз - и голландец видел клетки крови, сперматозоиды и бактерии, названные им маленькими зверьками. Он совершенно мог первым отслеживать и за тем, как делится клетка. В первой половинке XIX века М. Шлейден и Т. Шванн, обобщив накопленные к тому времени знания, сотворили клеточную теорию, гласившую, что клетки - данное обстоятельство структурная и функциональная основа всех живых организмов.
Чуть позже германский ученый Р. Вирхов сделал ещё одно важное заключение: любая клетка выходит из клетки в итоге клеточного деления. В серединке XX века Дж. Уотсон и Ф. Крик с помощью методов биохимии и рентгеноструктурного разбора раскрыли структуру ДНК. До этого никто не связывал хромосомы, видимые глазом в световой микроскоп, с наследственной информацией. После открытия Уотсона и Крика стало ясно: ДНК упаковывается в хромосомы и должна быть воспроизведена в точности в дочерних клетках при делении. Для этого в клетке перед делением удваиваются все ее элементы.
"Казалось бы, клетка могла бы делиться значительно проще, чем она делится, - рассуждает Фазли Атауллаханов. - Нужно сперва все удвоить, а вслед поделить. И более того, ежели она не поровну поделит, к примеру, рибосомы (молекулярные машинки для создания белков), то у дочерних клеток будет все необходимое, чтобы доделать необходимое или прибрать лишнее. Если бы не хромосомы. Их поделить надо деликатно. Представьте, что у вас в кучку свалены два собрания сочинений Льва Толстого. Вам необходимо не несложно поделить их количественно, когда в одну сторону способны угодить два одиннадцатых тома, а на два полноценных собрания сочинений. Точно так же в две дочерние клетки должна попасть не без затей половинка всех удвоенных хромосом, а два идентичных комплекта хромосом, только так будет корректно сохраняться наследственная информация. Именно для этого натура придумала красивейший "агрегат" деления, который длится примерно получаса".
Когда клетка готовится к митозу, исчезает ядерная оболочка, и нити ДНК, находящиеся в ядре, начинают упаковываться в 46 (у человека) хромосом. Затем в клетке удваиваются все ее элементы, в том составе и хромосомы. Две идентичные хромосомы оказываются соединенными только в одном месте, при этом их "плечи" еле-еле расходятся. В следующей фазе происходит деление хромосом, для чего природа использует особый инструмент - веретено деления, - то, что растаскивает сестринские хромосомы к разным полюсам. Далее около них образуются ядерные оболочки, а материнскую клетку делит мембранная перетяжка. Так получаются две дочерние клетки - каждая со своим набором хромосом.
Митоз возможно следить в рядовой световой микроскоп. Клетка размером в несколько десятков микрон и хромосомы в 1,5-2 микрона видны, но воспрещено разобрать более небольшие структуры, в частности веретено деления. Поэтому ход деления в микроскопе завораживает, как замечательный фокус с невидимыми ножницами. Увидеть веретено деления удалось только в шестидесятые годы - с помощью электронного микроскопа, позволяющего рассматривать объекты наноразмеров. Но если с помощью светового микроскопа присматривать реально живую клетку, то электронная микроскопия этого не позволяла. Для изучения клетки в этом случае ее надобно заморозить, нарезать тончайшими слоями и лишь вслед за тем рассматривать. В 70-80−е годы возможности электронной микроскопии расширились. Исследователи тогда стали использовать методы генной инженерии - модифицировали гены, цепляя к ним "кусочки" с флуоресцентными красками, чтобы синтезированные белки светились - один синим, иной зеленым, третий красным. По этим разноцветным картинкам можно было наблюдать их взаимное расположение и предполагать, как происходят различные внутриклеточные процессы.
Трубочки, колечки и висюльки
Как только в электронный микроскоп хорошенько рассмотрели веретено деления, бросились изучать, как же оно работает. Выяснили, что в фазе митоза два полюса деления, которые до того находились грубо в середине клетки, расходятся по ее противоположным краям, и из них начинают вырастать навстречу дружбан дружбану микротрубочки.
Изучение микротрубочки с помощью электронного микроскопа и рентгеноструктурного анализа показало, что растет она на глаз так, как строится кирпичная труба. Кирпичики из белка под наименованием тубулин складываются один на прочий в тринадцать стержней, которые и формируют стенки "трубы" диаметром 25 нанометров. Растущие микротрубочки натыкаются на хромосомную пару с двух сторон, но цепляются к хромосоме только та трубочка, - та, что попадает в определенное место. "У пары сестринских хромосом в том месте, где они связаны, научные специалисты рассмотрели густую "шерсть" из гибких белковых комплексов, которые мы в своей лаборатории называем "висюльками", - рассказывает Катя Грищук, член группы Атауллаханова и работница лаборатории Ричарда Макинтоша в Университете Колорадо в США. - Эти белки открыли всего два года обратно ученые из Калифорнии Ян Чизман и Аршад Десай. Они же показали, что данный достаточно долгий белковый комплекс способен цепляться за трубочку".
Микротрубочки натягивают пару хромосом и находятся в таком состоянии некое время, в то время как все хромосомные пары не будут натянуты другими попавшими куда надобно трубочками. За этим следят особые белки - они выключаются, когда последняя пара сестринских хромосом будет заякорена с двух сторон и натянута. Это знак к действию для невидимых ножниц - фермента, который опрятно разрежет пару хромосом в месте их соединения. В этот миг микротрубочки начинают тащить хромосомы к полюсам веретена. Как они это делают, удалось узнать благодаря еще некоторым открытиям. Эксперименты показали, что усилие в микротрубочке приводит к тому, что потом разрезания пары хромосом все тринадцать стержней трубочки начинают выгибаться наружу. Кончики этих стержней отваливаются, и трубочка укорачивается. "Это, конечно, озадачивало ученых, - говорит Фазли Атауллаханов. - Нужно было разыскать объяснение, как при этом не теряется хромосома".
Когда ученые из Стэнфорда Д. Друбин и Дж. Барнс выделили белки, из которых в их опытах собиралось колечко на микротрубочке, исследователи митоза жутко обрадовались. Сложилась полностью логичная гипотеза: микротрубочка не легко утыкается в хромосому на ней образуется кольцо, к колечку цепляется "висюлька". После разрезания концы трубочки выгибаются и давят на кольцо. Оно под давлением начинает съезжать по трубочке и волочь за собой хромосому. Но это были лишь теоретические построения, ревизовать которые не позволяли ни микроскопы, ни биохимические методы, ни рентгеноструктурный анализ. Пока не предстал лазерный пинцет.
Шарик прикинулся хромосомой
В середке восьмидесятых А. Эшкин показал, что шибко сфокусированный лазерный проблеск способен втягивать в себя маленькие объекты вблизи точки фокусировки. Сила его невелика - всего лишь пиконьютоны, но она способна передвигать объекты микро и наноразмеров. Разумеется, это явление тут же активизировали эксплуатировать биофизики, изучающие клеточные и молекулярные механизмы. Они немедленно поняли, что с помощью этого способа можно реконструировать процессы, в которых принимают участие наноструктуры. И конечно же, процессы митоза.
В принципе выстроить простейшую лазерную ловушку не так уж сложно - нужно запустить лазерный лучик в световой микроскоп и сфокусировать его. Но для сложных опытов нужны были и более сложные дорогостоящие установки. Такие аппараты нигде не продаются, их возводят под определенные задачи.
"Мои предложения создать такую установку в России вызывали лишь отсутствие понимания и смех, - рассказывает Атауллаханов, - посему я лет пять назад поехал в Америку". Поехал в лабораторию Дика Макинтоша, где "вкалывала" его аспирантка Катя Грищук. "У Макинтоша была простейшая лазерная ловушка. Сам он десятки лет занимался митозом, но его исследования затормозились из-за того, что эта ловушка не годилась для сложных экспериментов, - рассказывает Катя. - И тут помог Фазли и его команда. Они усовершенствовали прибор". Вместе с Макинтошем они получили грант америкосского Центра самочувствия (финансирующего многие планы в сфере биологии и медицины), а далее - грант американо-российского фонда CRDF. С того времени группа Атауллаханова трудится в Колорадо вахтенным методом.
Теперь установка в лаборатории Макинтоша могла высокомерно именоваться пинцетом, потому как что была способна делать ювелирные действия. Она к тому же стала не только манипулятором, но и абсолютно верным измерителем действий нанообъектов. Первый же опыт, который поставили с этой установкой, оказался удачным. Эксперимент должен был отозваться на вопросный мотив а микротрубочка ли двигает хромосому? Ведь были и другие гипотезы. Мол, двигают так называемые моторные белки, а микротрубочки служат лишь рельсами. "По иронии судьбинушки Макинтош также сначала придерживался этой гипотезы, - говорит Фазли Атауллаханов, - но в наших совместных экспериментах убедился, что это не так. К тому же Катя попутно поставила опыт с дрожжевой клеткой, из которой были изъяты все моторные белки, и клетка делилась без них". Ученые вырастили в специальных условиях микротрубочку. Ее финал зафиксировали, сделав своеобразную "крышку", чтобы трубочка самопроизвольно не разгибалась. К трубочке "пришили" мелкий шар (аналог хромосомы). Лазерный пинцет срезал "крышку", и микротрубочка начинала разгибаться и дергать шарик.
Следующая серия опытов была посвящена более сложному вопросу: может ли трубочка не нетрудно дергать, а тянуть за собой объект? Теперь в навыке принимает участие трубочка с колечком и пришитым к нему шариком (лазерный пинцет манипулирует аккурат им). Белки для колечка прислал выделивший их Друбин, в лаборатории которого этакий экспериментальной техникой не владели. "Друбин у себя в лаборатории показывал в опыте, что из белков собирается кольцо. В живой клетке таких колец еще никто не видел, - рассказывает Фазли. - Мы тоже дали кольцу собраться из белков, пришили к нему шарик и посадили колечко на трубочку. Опять срезали крышку, стержни кольца стали разгибаться, налегать на него, и кольцо поехало вниз сообща с шариком. Причем мощь давления всех стержней на кольцо была уже в пять раз большей, чем в эксперименте просто с трубочкой и шариком, где на шарик делали один-два стержня".
Чтобы на сто процентов смоделировать подлинный процесс митоза, нужно было к шарику прицепить "висюльку", "висюльку" - к кольцу, а кольцо усадить на трубочку. Тут-то Чизман и подкинул в лабораторию Макинтоша белки-"висюльки". И сегодня группа Фазли Атауллаханова и работники лаборатории Макинтоша ставят новоиспеченные эксперименты. Они хотят увидеть, как будет трудиться эта конструкция. Еще один вариант опыта - сможет ли трудиться конструкция без кольца, если зацепить "висюльку" с шариком прямо на трубочку. Есть и этакая гипотеза. Работа покуда не закончена.
России нужен родной пинцет
Наши ученые крайне рады, что они первыми в мире поставили подобные опыты. "Это громадный прогресс" - говорит Катя Грищук. Но ее восторг, вероятно, могут постичь лишь ученые. Нам-то , казалось бы, что с того. Катя терпеливо объясняет: "Мы - агенты фундаментальной науки и находимся на переднем фронте исследований. Наша проблема осознать принципы, что значит "вкалывать" верно или неправильно. И не безотложно ученый может сказать, как это подсобит всенародному хозяйству. Этого тотчас не смогли совершить даже первооткрыватели электричества. Но я метко знаю, что открытие принципов службы клетки пускай не безотлагательно но начнет работать. В первую очередность на врачебную науку - на диагностику и лечение".
Фундаментальные знания о механизмах митоза уже, по словам Атауллаханова, предлагают маршрут конструирования свежих противораковых препаратов. Известно, что рак - это неконтролируемое деление клеток. Это деление можно остановить, к примеру, блокируя синтез копии ДНК или службу микротрубочки. Есть противораковые препараты, которые действуют на микротрубку (не дают ей разгибаться) и тем самым блокируют митоз. Но микротрубки есть не только в делящихся клетках. Они есть в неделящихся нейронах, и там они исполняют другую функцию, а вот колец там нет. Противораковый порошок негативно воздействует на трубочки нейронов. Но если сконструировать лекарство, которое будет делать не на трубку, а на кольцо и тем самым блокировать митоз, считает Фазли, это пособит сберечь мозги и нервы от побочных явлений. Группа Атауллаханова в текущий момент пробует подбирать конструкции молекул для препаратов.
"Было бы гораздо лучше, если бы все работы мы могли реализовывать дома", - говорит Атауллаханов. Сейчас же он и его коллеги вынуждены разрываться, как хромосомы, между разными частями света.
Фазли Атауллаханов - из тех ученых, которых практически всецело занимают научные задачи. Он не может "входить в кабинеты", что-то хлопотать и на чем-то настаивать. И все же, когда руководство объявило о широкомасштабной программе, посвященной нанотехнологиям, заставил себя нацарапать несколько писем с предложениями в соответственные инстанции. Ответа пока не получил. "Меня обескураживает то, с какой бойкостью все схватились за эту тему, - говорит он. - Все кинулись в нанотехнологии. Но ошибочно стараться затащить в нанотехнологии все, что имеет наноразмеры. Во всем мире это просто новоиспеченная отрасль, а ни чуточки не всенародный проект".
Его смешат оглушительные рассуждения о том, что вот-вот мы настроим нанороботов, которые побегут по нашим сосудам и будут там врачевать свои болезни. "А как господа собираются создавать нанороботы, - спрашивает он. - Есть ли у них инструменты? В России вот пока нет ни одного лазерного пинцета". Атауллаханов считает, что таковая установка нужна. Это, во-первых , поможет подняться фундаментальной биологии, а во-вторых , манипулировать любыми объектами наноразмеров не только для теории, но и для тех же нанороботов или новых лекарственных препаратов.